[생화학 실험] 열에 안정한 DNA 중합효소의 정제(Purification of Thermostable DNA polymerase)

소개글

생화학

목차

1. 실험제목
2. 실험일자
3. 제출자
4. 목적
5. 원리
6. 시약 및 기자재
7. 결과
8. 고찰
9. 참고문헌

본문내용

실험제목
Purification of Thermostable DNA polymerase
실험일자
목적
Taq polymerase를 overexpression 시키고, purification 한다.
원리
1. Taq polymerase
Thermus aqaticus에서 추출한 94kDa 정도의 protein으로 74℃에서 DNA를 replication 시키고, 95℃에서 40분의 half-life를 보이는 enzyme이다. magnesium의 존재하에 nucleotide들의 5‘->3’ polymerization을 촉진하여 DNA duplex를 만들며, 5‘->3’ exonuclease activity를 보이나, 3‘->5’ exonuclease activity는 보이지 않는다. 즉, primer를 제거하는 기능은 있으나, proof-reading의 기능은 없다. optimal reaction condition은 1.4mM MgCl2, 50~55mMKcl, pH7.8~9 at room temperature (pH7.2 at 74℃) 이고, 고온에 강하여 74℃에서 최대 활성을 보인다.

3. Ion exchange chromatography (Separation based on charge or hydrophobicity)
Ion exchange chromatography 는 ionic charge의 정도와 nature에 따라 compounds를 분리한다. 단백질의 타입과 charge의 세기에 따라 column을 선택한다. Anion exchange resins은 (+)charge를 띠고 있으며 negatively charged compounds를 분리하고, cation exchange resins은 (-)charge를 띠고 있으며 positively charged molecules를 분리한다.
분리전에 buffer를 넣어준다. 이것은 반대 전하를 띈 이온을 equilibrate시키기 위한 것이다. sample을 넣고, solute molecules는 buffer ions와 reain의 binding site를 놓고 경쟁하여 교환된다.

참고 자료

-학부생화학실험(2) 후반부 교재
-http://en.wikipedia.org/wiki/Aziridine
-http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_purification
-http://blog.naver.com/hgsaem?Redirect=Log&logNo=150005363105