Preparation of plasmid DNA

소개글

수의과대학
생화학 실습
Preparation of plasmid DNA

목차

Objects
Introduction
Methods
Discussion

본문내용

<Objects>
- Cultured cell로부터 alkali 방법을 이용하여 plasmid DNA를 isolation 시키는 방법을 익힌다.
- 실험 중 사용되는 각 Solution(I, II, III..etc)들의 작용기전과 역할을 이해한다.

<Introduction>
1. Preparation of Plasmid DNA by Alkline Lysis (isolation)
- 각 Solution의 성분의 기능을 이용하여 bacteria의 cell membrane을 제거하고 필요없는 E.coil chromosol DNA와 기타 물질을 제거하여 최종적으로 순수한 plasmid DNA를 확보한다
1) bacteria cell membrane의 unstable化
Cell membrane은 대부분이 phospholipid로 이루어져 있다. 이 phospholipid는 (-)charge( or zero charge) 를 띄고 있기 때문에 서로를 밀어내는 척력이 작용하고 있어 매우 unstable하다. 때문에 각 cell은 membrane에 Mg+가 부착되어 salt bridge를 형성하며 척력을 상쇄, stable한 상태를 이룬다. Solution I의 한 성분인 EDTA는 Phospholipid와 결합하고 있는 Mg+와 binding하여 Chelate compound를 형성하여, membrane의 Mg+를 제거한다. 결국 Cell membrane은 unstable化된다.
2) E.coil DNA(chromosome)와 pretein의 denature and cell membrane breaking
Solution II에 포함된 NaOH는 pH를 급격히 올려준다. 때문에 E.coli chromosomal DNA는 수소결합이 깨지며 DNA double helix구조가 깨진다. 또한 Solution II에 포함되어 있는 SDS가 cell membrane을 파괴하고 protein또한 denaturing 시키기 때문에 결국 Solution II에 의하여 denature된 chromosomal DNA와 pretein은 aggregation된다. 이와 다르게 plasmid DNA는 Covalently closed circular DNA(supercoiled DNA)이기 때문에 Solution II의 영향에 비교적 강하다. 그러나 Solution II를 투여후 혼합시에 강력하게 vortex 할 경우 plasmid DNA에도 손상을 입을 수 있기 때문에 가볍게 혼합하는것에 주의해야한다.
Denature된 물질은 centrifuge로 제거한다.
3) 중화/안정화
Solution II의 pH가 매우 높기 때문에 plasmid DNA가 장시간 노출될 경우 이또한 손상될수 있으므로 Solution III로 다시 안정화시켜준다. Solution III의 Acetic acid는 pH를 다시 적정수준으로 낮추어 주며, potassium acetate는 plasmid DNA의 (-)charge를 중화시켜줌으로서 서로 뭉치게 안정화 시켜준다.

참고 자료

분자생물학노트 유전공학연구소 곽주원외 제2판 1995년 한림원 p60~64
실험 생화학 한국 생화학회저 1997년 탐구당 p331~343
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http://www.fronine.com.au/b3.asp
http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_20.php