western blot analysis protocol

소개글

* 사진 첨부로 각진행단계 상세히 설명하였습니다.
Acrylamide 를 가교제 (cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel 은 acrylam ide 와 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel 내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을 분리에 널리 사용돼 왔다.
Polyacrylamide gel 은 acrylamide 측쇄 기능기가 N,N`-methylene bisacryla mide 와 같은 2 개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 비가역적으로 중합되어 형성된 polymer 이다.
가교제로는 N,N`-methylene bisacrylamide 이 (일반적으로 bisacrylamide 라 한다) 많 이 사용되고 있으며, 또는 N,N`-bisacrylylcysta mine (BAC), N,N`-diallyltartardiamine (DATD), Ethylene diacrylate (EDIA) 등도 특수한 목적으로 사용되기도 한다.
생체물질의 효과적인 분리 범위는 polyacrylamide 의 농도와 가교제와의 중합 정도에 의해 결정되며 가교제에 의해 중합되어 생긴 gel 은 적절한 강도와 탄성을 유지하고 polypeptide 가 통과할 작은 구멍을 형성한다. 이 구멍의 크기는 가교제와 polyacrylamide 의 비율이 증가할수록 감소하여 약 1:20 정도에서 가장 작게 된다.

목차

1. 시험 원리

2. 시약 준비에 필요한 기구 및 시약명
가. 시약명
나. 제조시약
다. 기구

3. 시약 준비 방법
가. 8% Separating gel
나. 4% Stacking gel
다. 5X Sample buffer(5X loading Dye)
라. 5X Running buffer
마. Transfer buffer (주의점 : Do not add acid or base to adjust pH[8.1~8.4])
바. Blocking solution
사. TBS/T
아. 10X TBS
자. 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)/0.5M Tris-HCl(pH 6.8)
차. 10% (w/v) SDS
카. 10% Ammonium persulfate(APS)
타. Coomassie Destaining s olution(gel staining)

4. 시험방법

본문내용

1. 시험 원리
Acrylamide 를 가교제 (cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel 은 acrylam ide 와 가교제의
농도 및 비율에 의해 gel 내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을
분리에 널리 사용돼 왔다.
Polyacrylamide gel 은 acrylamide 측쇄 기능기가 N,N`-methylene bisacryla mide 와 같은
2 개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 비가역적으로 중합되어 형성된 polymer 이다.
가교제로는 N,N`-methylene bisacrylamide 이 (일반적으로 bisacrylamide 라 한다) 많 이
사용되고 있으며, 또는 N,N`-bisacrylylcysta mine (BAC), N,N`-diallyltartardiamine (DATD),
Ethylene diacrylate (EDIA) 등도 특수한 목적으로 사용되기도 한다.
생체물질의 효과적인 분리 범위는 polyacrylamide 의 농도와 가교제와의 중합 정도에 의해
결정되며 가교제에 의해 중합되어 생긴 gel 은 적절한 강도와 탄성을 유지하고 polypeptide 가
통과할 작은 구멍을 형성한다. 이 구멍의 크기는 가교제와 polyacrylamide 의 비율이
증가할수록 감소하여 약 1:20 정도에서 가장 작게 된다. 대부분의 polyacrylamide gel 은
1:29 의 몰 비율로 제조하며 사용하고 있으며 이 비에서 분자량이 3% 정도의 차이가 있는
polypeptide 를 분리할 수 있다.
bisacrylamide 의 %중량이며 %C 는 가교제인 bisacrylamide 의 %중량이다.
따라서 %T 와 %C 가 커지면 그만큼 미세통로의 크기는 작아지게 되어 작은 물질의 분리에
이용할 수 있게 된다.
Acrylamide 의 중합은 ammonium persulfate (APS) 또는 riboflavin 의 첨가에 의해 개시된다.
APS 를 사용하는 경우에는 촉매제로 N,N,N`,N`-tetramethylethylenediamine (TEMED)를
사용하며 TEMED 는 persulfate 로부터 자유라디칼의 생성을 촉매함으로써 중합을 개시한다.

참고 자료

없음