Western Blot (Immunoblot)

소개글

Western Blot (Immunoblot)

목차

Western Blot (Immunoblot)
Ⅰ. Introduction
1.1. 이론
1.2. 목적

Ⅱ. Materials and Methods
2.1. Materials
2.2. Methods

Ⅲ. Results
Ⅳ. Discussion

본문내용

Ⅰ. Introduction
1.1. 이론
Western blot(immunoblot) method는 SDS-PAGE를 통한 단백질 분리 후 antigen을
찾는데 사용된다. SDS-PAGE 후 단백질은 nitrocellulose membrane으로 옮겨진다. (단 백질은 nitrocellulose membrane에서 고정되어 질 것이다.) 그 다음 membrane은
background를 blocking하기 위해 nitrocellulose membrane에서 5% non-fat dry milk
solution에 의해 적셔진다. 이것은 다음의 순서 동안 background에 antibody가 붙는 것 을 방지한다.
Blot은 antigen 에 대항하여 준비된 primary antibody 와 함께 배양된다. 이 antibody는
nitrocellulose membrane에 붙어있는 antigen 분자들에 붙는다. 그다음 blot은 공유
결합적으로 효소(alkaline phosphatase)에 연결되어 있는 secondary antibody와 함께
배양된다. 이 antibody는 1°antibody에 반하여 준비된 것이다. 그래서 이것은
antigen-antibody complex를 만든다. Alkaline phosphatase substrate (BCIP/NBT
solution)은 nitrocellulose membrane에 antigen, 1°antibody, 2°antibody, alkaline
phosphatase complex의 존재를 확인하기위해 첨가된다.
이 때 사용하는 항체는 찾고자 하는 항원(단백질)에 대해 특이하게 반응하는 것을 방사성 동위원소로 표식하여 사용하거나 또는 특정 효소(예: alkaline phosphatase, horseradish peroxidase 등) 또는 형광을 나타내는 색소(예: FITC: fluorescein isothiocyanate)를 결합시킨 것을 이용함으로써 찾고자 하는 적은 양의 단백질을 가시화할 수 있다.

참고 자료

없음