RT-PCR실험 보고서 및 시약 조사

소개글

RT-PCR 실험 후 나온 결과를 토대로 작성한 보고서 입니다.
학부생 수준이라 미흡한 점이 없지 않아 있지만, TRIZOL, DEPC treated DW, primer 등의
조사도 같이 해서 공부하기에는 유용합니다.

목차

1. Introduction
2. Method
1)RNA prep protocol
2)RT(Reverse transcription) protocol
3)mRNA amplification using prepared cDNA
4)Loading on Agarose gel
3. Result
4. Discussion
1)시약조사
2)프라이머 종류
5. Reference

본문내용

1. Introduction
PCR(Polymerase Chain Reaction)이 DNA를 증폭시키는 방법이라면, RT(Reverse Transcript)-PCR은 RNA를 찾고 분석하는데 도입된 방법이다. 대장암 세포인 SW480를 가지고 RT-PCR의 원리를 배워보았다.

2. Method
RNA prep protocol
1) 세포 배양 plate에서 media를 제거한 후 1ml의 TRIZOL로 세포에서 DNA와 RNA를 유리한다.
2) DEPC 처리된 튜브에 옮기고 200ul chloroform 처리한다.
3) Chloroform에 의해 RNA를 제외한 DNA와 protein이 응집되면 4℃에서 15분간 원심 분리해서 상대적으로 무거운 TRIZOL과 DNA, protein등을 아래로 침전 시킨다.
4) 그림 1처럼 3개의 층이 생긴 튜브에서 RNA가 있는 상층을 pipet을 이용, 다른 튜브로 옮긴다.
5) RNA가 있는 aqueous phase에 500ul isoprophanol 처리해 RNA만 뭉치게 한다.
6) 4℃에서 15분간 원심 분리 후 상층액을 제거한다.
7) 75% ethanol 1ml 처리 후 다시 한번 원심분리, 상층액
(ethanol)을 제거해준다.
8) Ethanol을 모두 휘발 시켜 RNA pellet만 남겨두고 DEPC 처리된 D.W.로 RNase를 제거한다.
9) 260nm(RNA, DNA)와 280nm로 흡광도를 측정한다.

RT(Reverse transcription) protocol
1) 1ul의 OligoDT 와 증류수를 넣고 70℃에서 10분간 1차 반응 시킨다.
2) 5X buffer 4ul 0.1M DTT 2ul, 10mM dNTP mix 1ul RT 1ul를 넣고 42℃에서 50분간, 70℃에서 15분간, 4℃에 놔둔다.

참고 자료

Klug, Concepts of Genetics 8ed, Pearson Prentice Hall
황혜진, Essentials of 유전학 5판, 월드사이언스
Naver 백과사전
Wikipedia