Protein determination by colorimetric reaction (단백질정량분석)
- 최초 등록일
- 2008.04.15
- 최종 저작일
- 2007.10
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소개글
이번 실험은 Lowry가 고안한 sensitivity가 높은 단백질 정량 분석법을 통해 BSA를 이용하여 완성한 standard curve를 통해 cell-extract의 단백질 농도와 specific activity를 구하는 것이다. 측정한 흡광도(O.D)를 통해 BSA 내의 단백질 농도를 구할 수 있고, 분석결과 얻은 Vmax 값을 통해 specific activity를 얻을 수 있었다.
목차
1. Astract
2. Introduction
Lowry 실험 (Folin - Ciocalteu 실험)
activity(활성) 와 specific activity(비활성)
3. method
4. Data & Results
5. Discussion
6. Reference
본문내용
이번 실험은 1μg으로 sensitivity가 높은 Lowry assay를 이용하여 미지의 단백질의 농도를 구하고, ϐ-galactosidase를 ONPG에 대한 효소로 사용했을 때의 Vmax값을 연관시켜 specific activity를 구해보는 실험이었다. Lowry assay는 Biuret 반응과 tyrosine과 tryptophan에 의한 phosphomolybdate-phosphotungstate의 환원반응이이 합쳐진 단백질 정량법이다. 우선 Biuret반응은 알칼리 조건하에서 Cu2+가 peptide nitrogen atom과 결합하여 보라색의 착화합물을 형성하고 540~560nm에서 흡광하는 것을 이용한 단백질 정량법이다. Biuret반응은 sensitivity가 매우 낮기 때문에 Biuret반응을 기초로 하여 sensitivity를 높은 것이 Lowry assay이다. Bieuret반응에서 생성된 Cu2+가 Folin-ciocalteu와 tyrosine, tryptophan에 의해 환원반응을 일으켜 푸른색을 발색하며 이것을 750nm에서의 흡광도를 측정하여 단백질 정량을 한다. 우선 농도를 알고 있는 BSA를 각 농도별로 A70을 측정한다. 이것은 calibration curve를 그리기 위함이다. calibration curve를 그린 후 추세선을 이용하여 cell extract의 농도를 구할 수 있다. 추세선인 y = 0.0038x -0.071에 cell extract의 OD값을 대입하면 단백질 농도가 3.145mg/ml이 나온다. 이렇게 구한 농도로 total protein의 양을 구하고 지난실험의 Vmax를 이용하면 specific activity를 구할 수 있다. specific activity = Total activity/total protein이로서 단백질 1mg당 효소의 단위수(unit)로 나타낸다.
참고 자료
Nelson, Cox Lehninger Biochemistry 4th edition 2004 by Freeman, pp89~95
한국생화학회 실험 생화학 개정3판 1997 by 탐구당, p177, pp200~202
