[생명과학]Gene cloning(Making recombinant DNA)

소개글

우리가 원하는 gene(insert)을 vector에 삽입한 뒤, E.coli에 transformation시켜서 colony를 얻어낸다. 얻은 colony 중 우리가 원하는 clone이 포함되어 있는 것을 찾아내어 그 안에 정말 재조합 DNA가 들어있는지 확인한다.

목차

1. Enzyme digestion and gel loading
2. Gel extraction
3. DNA ligation
4. DNA prep(mini-prep)

본문내용

이번실험은 재조합 DNA를 만들고, 그것을 추출하는 방법과 재조합 DNA를 screening하는 방법까지 총 3주에 걸친 것이었다. 실험에 사용한 vector는 pGLAO이고, insert는 pGEX-5X-2였다. 우리는 이 실험에서 mini-prep까지만 하는 것으로 실험을 끝내었지만, 원래 이 실험은 protein-protein interaction을 알아보는 mammalian two hybrid라는 실험의 중간과정에 속하는 것이다. (중략)
먼저 1주차 실험에서는 두개의 플라스미드(pGALO, pGEX-5X-2-INCA1)를 BamH1,Xho1,Sal1으로 자른 다음 electrophoresis하고 원하는 band를 잘라 보관하였다. (중략)
2주차 실험에서는 gel extraction을 하고 ligation 비율을 정하여 ligation을 해 보는 것이었다.(중략)
우리조는 결과에서 보듯 vector : insert = 2 : 1 정도 되었고, 따라서 두 band에 포함되어 있는 DNA의 양은 1 : 3 이라고 할 수 있다. 따라서 ligation시 plasmid : insert = 1 : 1로 넣어주게 된다.
3주차 실험에서는 ligation된 재조합 plasmid를 competent cell에 넣는 것을 하였다.
(중략)
다음으로 mini-prep을 하였는데, 우리가 원하는 recombinant DNA가 transformation되었을 것이라 생각하는 colony의 bacteria에 P1 solution을 넣어준다. P1 solution에는 EDTA가 들어있어 세포벽의 integrity를 유지하는데 필요한 Ca2+을 제거함으로써 세포벽의 permeability를 높여주고, glucose가 포함되어 있어 삼투압을 유지하여 세포벽이 느슨하게 되었는데도 불구하고 세포의 형태를 유지하게 만든다. P1 solution을 넣은 후에는.....

참고 자료

가) http://100.naver.com/100.php?id=709429
나) http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/agarose_gel.php
다) http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/restriction_enzyme.php
라) http://bioinfo.sarang.net/wiki/YeastTwoHybrid?highlight=%28yeast%29
마) FRET microscopy imagimg of live cell protein localizations.
Cell Biol. 2003 Mar 3;160(5):629-33. Review
바) Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev Cell. 2003 Mar;4(3):295-305. Review