[일반 화학]액체 크로마토그래피

소개글

1. Introduction
이 실험에서는 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)를 이용하여 커피 내에 들어있는 카페인을 정량분석한다. 커피 내의 카페인의 농도를 알아내기 위해서 우선 카페인의 retention time을 알아내고, UV absorbance detector를 검출기로 사용하여 최대흡광파장을 찾아서 Lambert-Beer의 법칙을 이용해 커피의 크로마토그램에서 카페인의 양을 구해낸다.

2. Procedure
첫 번째 실험에서는 해당 조건에서 adenine과 caffeine의 retention time을 구해낸다. Retention time은 용액을 주입하여 크로마토그램의 peak가 관찰되기까지의 시간이며, 이는 해당 조건에서 한 물질에 대해 항상 일정한 값을 나타낸다. 이를 통해 여러 물질이 섞인 용액을 분석할 때 크로마토그램에 나타난 물질이 어느 것인지 분석할 수 있다. 각 물질은 역상 C18 column에서 H20:CH3OH = 60:40 의 용액을 eluant로 사용하여 분석하며, 자외선 흡광광도계를 이용하여 지나가는 물질의 흡광량을 측정한다. 실험에서는 실험실에 제작되어 있는 adenine과 caffeine 용액을 1mL씩 사용하였다. 분석 프로그램을 이용하면 시간에 따른 흡광도를 그린 그래프를 통해 각 물질의 retention time을 알 수 있다.
두 번째 실험에서는 adenine과 caffeine의 흡수 스펙트럼을 작성한다. 이에는 위에서 사용한 두 용액을 혼합하여 파장을 변화시키면서 용리하여 결과를 얻는다. 실험에서 사용한 파장은 250nm, 260nm, 270nm, 280nm이다. 각 물질은 고유의 최대흡수파장을 갖는데, 이 파장에서 물질이 가장 민감하게 빛을 흡수하므로, 흡광도를 이용하여 물질의 농도를 측정하기 위해서 최대흡수파장을 측정할 필요가 있다. 위의 각 파장의 흡광도 결과를 plot해 보면 caffeine이 최대로 흡광하는 파장을 알 수 있으며 이를 다음 실험에 사용한다.
세 번째 실험에서는 1/10으로 희석된 커피 용액 내의 caffeine을 정량분석한다. 이를 위해서 우선 농도를 정확히 알고 있는 100μM과 200μM의 caffeine 용액의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성한다. 이 표준곡선은 Lambert-Beer의 법칙에 의한 농도와 흡광도 간의 비례관계를 보여주는 곡선이 된다. 그 후 커피 용액을 용리하여 caffeine의 농도를 알아낸다. 이 때 커피의 크로마토그램에는 여러 peak들이 나타나나, 첫 번째 실험에서 구한 retention time을 이용하여 caffeine의 peak를 알아낼 수 있으며, 이의 흡광도를 표준곡선의 식에 대입하여 그 농도를 구해낸다.

목차

1. Introduction
2. Procedure
3. Results
실험 1. Adenine과 caffeine의 분리
실험 2. Adenine과 Caffeine의 흡수 스펙트럼
실험 3. 커피에서 Caffeine의 정량분석
4. Discussion
실험 1의 결과에 대해
실험 2의 결과에 대해
실험 3의 결과에 대해
추가 질문
• Adenine과 caffeine의 retention time 및 그 재현성
• Eluant의 메탄올 함량을 늘렸을 때의 retention time의 변화
• Adenine과 caffeine의 흡수스펙트럼 및 최대흡수파장
• 흡광도 값의 비로부터 미지시료 용액의 농도를 구하는 데 사용되는 법칙
• Freeze-dried coffee에 들어있는 caffeine의 무게 퍼센트
• 시간이 충분히 주어질 경우 보다 정확한 정량을 위해 할 추가 실험
• Assignment: 실생활에서의 HPLC 사용 예

본문내용

다음은 각각 adenine과 caffeine을 용리하여 얻은 흡광도의 그래프이다. 여기서 y 축은 계기에서 전달되는 신호의 전압으로 되어 있는데 이는 흡광도에 비례하므로 흡광도와 같이 생각할 수 있다. Retention time은 주입을 시작하여 (0.00 min) peak가 나타날 때까지의 시간을 의미하는데, 이는 한 조건에서 물질의 극성과 같은 특성에 의해 결정되는 고유한 값으로 같은 조건에서 실험했을 때 항상 같게 나오므로 이를 이용하여 여러 물질이 섞인 용액의 크로마토그램으로부터 해당 물질의 존재 여부 및 그 양을 알 수 있다. 이는 그래프에서 뾰족한 부분이 나타나는 시간으로 알 수 있는데, 각각 adenine은 2.0250 min, caffeine은 3.5900 min 임을 알 수 있다.

다음은 4개의 파장에서 adenine과 caffeine의 혼합 용액을 용리하여 얻은 결과이다. 4개의 파장에서의 실험은 연속적으로 수행하였으며, 위 실험 1의 결과에서 adenine의 retention time이 caffeine 보다 더 짧음을 확인하였으므로 위의 그래프에서 각 4개 높고 낮은 peak의 쌍의 앞의 것이 adenine, 뒤의 것이 caffeine의 흡광도임을 확인할 수 있다. 여기서 흡광하는 양을 비교하기 위해 peak 아래의 면적을 적분한 값을 사용하였는데 이는 물질이 고정상을 통과하면서 일정한 농도의 구간으로 지나가는 것이 아니라, 확산에 의하여 연속적으로 변하는 농도로 지나가기 때문이다. 따라서 측정되는 흡광도도 시간에 따라 변하게 되는데 물질이 흡수한 총 빛의 양을 알기 위해서는 위 그래프를 적분할 필요가 있다. <표 1>에서는 이를 통해 얻은 각 peak의 적분 면적과 각 peak의 최대 높이인 maximum을 표시하였다. 또한 <그림 4>는 파장과 적분 면적 (흡광 정도)를 plot한 것이며, maximum은 적분 면적에 비해 중요하지 않기 때문에 그래프를 생략하였다. 그래프를 관찰할 때 실험에 사용한 파장 중, adenine은 260nm, caffeine은 270nm의 빛을 가장 잘 흡수함을 알 수 있다. Lambert-Beer 법칙에 의해 농도와 흡광도의 관계를 구할 때 물질이 가장 민감하게 흡수하는 빛을 사용할 필요가 있으므로 다음 실험에서는 여기서 구한 caffeine의 최대흡수파장 270nm을 이용하게 된다.

다음은 커피 내 caffeine의 양을 알아내기 위해 270nm에서 caffeine 용액의 농도-흡광도 표준곡선을 작성한 것이다. 이를 위해 농도를 알고 있는 100μM과 200μM의 caffeine 용액을 이용하였다. 먼저 100μM 용액을 주입하고 그 다음 200μM 용액을 주입하였으며, <표 2>는 그 결과 얻어진 각 peak의 적분 면적과 최대 높이이다. Lambert-Beer의 법칙은 용액의 흡광도는 그 농도와 빛이 투과하는 두께에 비례하게 됨을 말하며, 이는 A=εbC (ε: 흡광계수, b: 두께, C: 농도) 의 식으로 나타낼 수 있다. 위의 자료들을 이용하여 A ...

참고 자료

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Masterton & Hurley, Chemistry, 5/ed, 2004, Thomson, Periodic Table of the Elements