[단백질]2차원 전기영동

목차

1) SDS-PAGE
2) IEF

Peptide mass fingerprints : MALDI-TOF MS
1) Trypsin digested peptides
2) MALDI-TOF MS의 원리

A. 배양세포로부터 단백질의 분리

본문내용

모든 단백질들은 구성하고 있는 amino acid에 따라 질량과 pI (isoelectric point)값이 다르다. 따라서 이 두요인을 이용하여 단백질을 분리할 수 있다. pI를 이용하여 단백질을 펼치는 방법을 IEF (isoelectric focusing)라고하며 질량에 의해서 단백질을 펼치는 방법을 SDS-PAGE
(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)라고 한다.

1) SDS-PAGE
비교적 조작이 간단하고 재현성이 두드려짐

2) IEF
pI값에 의해서 단백질을 펼치는 방법은 1975년 O`Farrell에 의해서 개발 [O`Farrell (1975) High
resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. JBC 250, 4007-4021]
① IEF의 한계
- Gel에 loading 할 수 있는 단백질양이 적다 : spot을 찾더라도 분석이 불가능
-재현성이 낮다.
② IEF 한계의 극복 : IPG (immobilized pH gradient gel)
- Gel에 loading할 수 있는 단백질의 절대량이 약 100배 증가 (mg 단위)
- IPG gel strip이 상품화 : 재현성이 증가
③ IPG란
- pH gradient를 만드는 물질을 immobiline이라는 zwitter ion을 사용
- Immobiline을 함유한 polyacrylamide gel : IPG strip
-단백질의 위치가ampholyte의 배치에 따라 달라지는 것을 막을 수 있다.
④ 단백질의 loading
- cup loading
- IPG strip의 rehydration과 동시에 단백질을 loading : IPG strip의 rehydration시 단백질을 함께 넣어주면 polyacrylamide가 물을 흡수하는 과정에 단백질이 gel속으로 흡수.(figures 4 and 5) Peptide mass fingerprints : MALDI-TOF MS
(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time Of Flight Mass Spectrometry)

1) Trypsin digested peptides
Human cytochrome c (1-50 amino acid sequence)
GDVEK / GK / K / IFIMK / CSQCHTVEK / GGK / HK / TGPNLHGLFGR / K / TGQAPGYSYTA
→ 10개의 peptides (또는 amino acid) (figure 6)

참고 자료

없음