[세포생물학]PCR-Southern hybridization

소개글

Southern hybridization은 genomic DNA를 digestion한 것을 membrane으로 transfer하여 그 genome 안에 원하는 DNA 부위가 존재하는지를 볼 수 있는 반면, PCR-Southern hybridization은 원하는 DNA 부위를 PCR 기법을 이용하여 다량 증폭시킨 후 이 증폭된 부위를 probe를 이용하여 확인하는 방법이다. 즉, Southern hybridization에 비해 PCR-Southern hybridization으로 확인하는 것이 훨씬 용이하다.

목차

Ⅰ. Introduction.
1. 원리.
2. 조작법과주의점.
(1) DNA 추출과 제한효소에 의한 DNA의 절단.
(2) Agarose gel electrophoresis.
(3) gel 의 알카리 변성 및 중화.
(4) Blotting 과 DNA의 나이론막 고정.
(5) 소식자의 표지와Hybridization.
(6) 나이론막의 세정.
(7) 검출
<Material>
<Method>
<Result>
<Discussion>

본문내용

1. 원리.
이 방법은 genomic DNA를 하나 혹은 여러가지 제한효소로 자른 다음 생성된 각 DNA 조각을 agarose gel 전기영동하여 크기별로 분리한 후, gel 상에서 DNA를 변성시키고 gel로부터 solid support으로 이동시킨다. 이렇게 gel로부터 membrane으로 이동될 때 DNA조각들의 상대적인 위치는 유지되게 된다. Membrane에 부착된 DNA는 방사선 동위원소 혹은 비방사선 물질로 표지된 DNA 혹은 probe 와 hybridization되고 자가방사법등을 통해 그 위치를 가시화하게 된다. 이 방법을 응용하여 RNA를 분석하는 Northern blot, 단백질을 분석 분석하는 Western blot이 개발되었고, 원리는 크게 다르지 않다.

2. 조작법과주의점.
(1) DNA 추출과 제한효소에 의한 DNA의 절단.
Genome 써던 법에서 DNA의 추출은 일반적인 방법 그대로를 사용하여도 무방하며, 비특이적 절단이 되지 않은 고분자 DNA 의 사용이 필요하다. 추출시 DNA의 기계적 절단을 최소화 하도록 주의한다. 제한효소에 의한 소화는 5~20ug 의 DNA를 EP tube 에 첨가하고 10x buffer 및 제한효소 30~100unit을 첨가하고, 37`C 에 3시간에서 하루밤 반응을 시킨다. 효소의 종류에 따라 최적 Na salt 농도나 K salt의 buffer 가 다르기 때문에 적절한 buffer를 선택하는 것이 중요하다. 제한효소반응 후, 페놀 추출, 에탄올 침전하고 TE buffer 로 용해한 후에 색소액을 첨가한후 electrohoresis 한다.
(2) Agarose gel electrophoresis.
전기 영동은 submarine 형을 이용한다. 분획하는 DNA fragment를 따라 0.7~2%의 gel을 만든다. 보통 분석에는 0.7~ 1.2% gel 을 사용한다. buffer로는 TAE나 TBE 를 사용하며, 색소액으로는 BPB, XC 등의 색소에 ficoll 400, Sucrose, glycerol 등을 첨가하여 사용한다. 전기영동후에 gel 을 EtBr에 연색하고 UV lamp 위에서 band 상태를 관찰한다.

참고 자료

없음