[화공생물공학단위조작실험2] PCR 활용한 유전자 증폭 실험 예비레포트

소개글

동국대학교 화공생물공학단위조작실험2 2024-1 A+ PCR 활용한 유전자 증폭 예비레포트입니다.

목차

1. 실험 목표

2. 실험 원리
1) 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)
(1) PCR 과정
(2) 야생형(Wild type)과 돌연변이형(Mutant type)
2) 반응액의 조성
3) 전기영동 (Electrophoresis)

3. 시약 조사 & 실험 기구 및 방법
1) 실험 시약 및 기구
2) 실험 방법
1. DNA extraction
2. Polymerase Chain Reaction
3. Electrophoresis

4. 실험 시 주의사항

5. 참고 문헌

본문내용

1. DNA extraction
(1) 1/1000으로 희석한 Proteinase을 1㎖씩 E.P tube에 넣는다.
(2) 면봉을 사용해 구강 천장을 긁어 세포를 모으고, 희석한 proteinase solution에 넣는다.
(3) Solution을 37℃ 인큐베이터에서 30분간 incubation 한다.
(4) Incubation 후, 한 샘플 당 4개의 1.5㎖ EP tube에 200uL씩 나눠 담는다.
(5) (4)에서 준비된 tube에 20uL의 sodium acetate와 500uL 100% Ethanol을 각각 첨가한다.
(6) Tube를 15초 정도 Vortexing한 후 -80℃ deep freezer에서 15분간 냉각시킨다.
(7) 15000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리한다.
(8) 상층액을 제거한 뒤, 1㎖의 70% Ethanol을 넣는다.
(9) 15000 rpm, 4℃에서 2분간 원심분리한다.
(10) 상층액을 제거한 뒤 침출된 DNA를 20분간 상온에서 건조시킨다.
(11) 50uL의 DDW로 tube(1)에만 넣어 DNA를 풀어준 뒤, tube(1)의 용액을 다음 튜브로 옮겨 가며 나머지 tube의 DNA를 풀어 하나로 만든 뒤 vortexing해준다.
2. Polymerase Chain Reaction
(1) 한 샘플 당 wild, mutant type 총 2개의 Reaction Mixture(W, M)을 만든다.
Primer mix W: 10uM DNA Forward primer + 10uM DNA Wild Reverse primer
Primer mix M: 10uM DNA Forward primer + 10uM DNA Mut. Reverse primer
(2)Reaction Mixture의 구성성분을 모두 넣고 10uL 이상 파이펫으로 pipetting으로 섞는다.
(3)PCR 기기의 뚜껑을 열고 Reaction Mixture가 든 tube들을 모두 넣고 PCR 전원을 켠 뒤, cycle 수(34X) 및 각 단계의 온도와 시간을 아래대로 설정한 뒤 run을 눌러 시작한다.
3. Electrophoresis
(1) 50x TAE buffer를 1x TAE buffer 500mL가 되도록 증류수로 dilution한다.
(2) (1)에서 만든 1X TAE buffer 500mL 중 50mL를 작은 Bottle에 담아주고, 거기에 Agarose 질량이 1%(w/v)가 되도록 넣어준다.
(3) 뚜껑을 살짝만 닫은 후 충분히 녹을 때까지 전자레인지로 가열한다.
(4) 만졌을 때 따뜻한 정도가 되면 Redsafe를 전체의 1/20000이 되도록 넣는다.
(5) 녹은 agarose 용액을 틀에 천천히 붓고 comb를 꽂은 후 굳을 때까지 기다린다.
(6) 젤이 굳으면 comb를 조심히 뺀 후, 틀에서 gel을 빼내 전기영동기에 넣고 수평을 맞춘 뒤 gel이 다 잠길 정도로 1x TAE buffer를 부어준다.
(7) 각각의 sample에 6X loading buffer가 1X가 되도록 파라필름 위에서 pipetting으로 섞는다.
(8) Agarose gel의 한 well에 DNA marker 5uL를, 나머지 well에 한 well 당 (sample+loading buffer) mixture를 10uL씩 loading한다.
(9) 전기영동기 스위치를 누른 뒤 20분 동안 전기영동을 진행한다.
(10) Gel을 UV-transilluminator로 관찰한다.

참고 자료

화공생물공학과 교수진. (2024). 화공생물공학단위조작실험2. 동국대학교 화공생물공학과. 44-48.
서햇살, 최동욱, & 정은영. (2022). 일반계 고등학교에서 활용 가능한 유전자 재조합 실험 프로그램 개발 및 적용. 현장과학교육, 16(3), 411-424.
하정미. (2010). Clostridium difficile Toxin A 와 B의 신속한 검출을 위한 Real time PCR kit 의 개발 (Doctoral dissertation, 한양대학교).