소개글
약대 독성학 실험 레포트 입니다.
ROS-Glo H2O2 Assay를 통해 항암제 5-FU의 세포독성을 측정합니다.
목차
1. Title
2. Purpose
3. Principle
4. Method
5. Result
6. Discussion
본문내용
1. Title : ROS detection Assay
2. Purpose : ROS를 세포독성지표로 사용하여, CCCP 처리 조건에 따른 5-FU의 세포독성을 파악한다.
3. Principle
1) ROS-Glo H2O2 Assay
ROS-Glo H2O2 Assay는 ROS 중에서도 가장 반감기가 긴 H2O2를 측정할 수 있는 방법이다. 다양한 ROS들은 세포 내에서 H2O2로 변환될 수 있다. 예를 들어, SOD에 의해서 Superoxide를 H2O2와 O2로 변환시킬 수 있다. H2O2의 변화는 ROS level의 전반적인 변화를 의미한다. H2O2 Substrate은 H2O2와 직접적으로 반응하여 Luciferin precursor을 형성하고, 이에 Detection Reagent(Recombinant Luciferase와 d-Cysteine이 포함됨)처리하게 되면 precursor가 luciferin으로 전환된다. Luciferin은 Luciferase와 반응하여 H2O2 농도와 비례하는 luminescent signal을 나타낸다.
2) carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP)
CCCP는 oxidative phosphorylation의 억제제(uncoupler)로서, 산화 적스트레스와 ROS 형성을 유도하여 세포의 파괴와 죽음을 유발하는 물질이다. CCCP는 미토콘드리아 electron transport chain의 electron carrier들의 정상적인 활성으로 만들어지는 proton gradient를 uncoupling하고, ionophore로도 기능하여 ATP synthase의 기능을 저해하여 ATP합성을 억제한다.
4. Method
1) MC38(mouse colon cancer cell line)를 1x104 cell/well로 96 well plate에 seeding 하였다.
2) 16시간 동안 37°C CO2 incubator에서 배양하였다.
참고 자료
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Kane, M.S., Paris, A., Codron, P., Cassereau, J., Procaccio, V., Lenaers, G., ... & Chevrollier, A. (2018). Current mechanistic insights into the CCCP-induced cell survival response. Biochemical pharmacology, 148, 100-10.
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