분자생물학 실험 보고서-DNA재조합

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목차

1. 서론
2. 결과
3. 고찰
4. appendix

본문내용

재조합 DNA를 만들고 세균에 transformation 시켜서 삽입여부를 확인한다.

① 제한효소로 절단 후 purification
1) insert는 NheⅠ,XmaⅠ을 이용, vector 는 XbaⅠ, XmaⅠ을 이용해서 절단한다. 다른 제한효소를 사용해서 self ligation을 방지할 수 있다. (directional cloning)

NheⅠ과 XbaⅠ는 절단 부위가 다르지만 hangover가 같아서 ligation이 가능하다.

2) 1% agarose gel에서 전기영동 후 필요한 부분을 잘라 purification을 통해 분리한다.
◎ 전기영동
위쪽에는 (-)전극, 아래쪽에는 (+)전극을 연결해서 (-)하전된 DNA가 (+)극으로 이동하는 현상을 이용해서 크기에 따라 분리한다.
같은 모양 DNA일 경우 크기가 작을수록 빠르게 이동한다.
◎ silica column
chaotropic salt가 존재할 경우 DNA가 silica column과 강하게 결합하는 성질을 이용한다.
column에 결합한 DNA는 pH를 높여주면 분리시킬 수 있다.
② ligase를 이용해서 연결시킨다.
self ligation을 방지하기 위해서 vector에 phosphatase를 처리한 후에 ligation을 시킨다.

③ ligation을 한 DNA를 competent cell에 transformation 한다.
◎ transformation
먼저, competent cell을 만들기 위해 과 같은 multivalent ion 존재 하에 incuvation 한다.
그 다음, competent cell과 DNA를 37-42℃에서 heat shock을 주면 DNA가 세포 안으로 들어가게 된다.
④ transformation 한 세균을 암피실린배지에서 배양 후 colony에서 DNA를 얻고 제한효소로 잘라서 제대로 ligation이 되었는지 확인한다.

참고 자료

캠벨 생명과학
https://www.google.co.kr/search?biw=1280&bih
http://2014.igem.org/Team:Macquarie_Australia/WetLab/Protocols/PlasmidPreps
https://www.yourgenome.org/facts/what-is-pcr-polymerase-chain-reaction