[생화학] LDH 종합 실습

목차

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본문내용

1.Abstruct
이 실험은, 흰 쥐의 각 Organ 에서 쇄균액을 추출하여, 그 속에 들어 있는 특정한 Enzyme인, LDH를 가지고 Purification, Enzyme kinetics, 등을 통해서 specific activity와 각각의 Isotype 을 알아내는 것이 목적이다.

2. 실험 과정, 및 Result
1) Organ에서 homogenation 된 용액을 ammonium sulfate 35% 용액과 반응시켜서 LDH이외의 다른 Protein들을 제거한다.
2) 위에서 얻은 상층액을 가지고 다시 65% ammonium sulfate 용액과 반응시켜서 LDH가 응고되도록 한다. 이 때, 다른 Protein 들도 35%~ 65% 안에서 응고되는 것들은 같이 침전될 것이다.
3) 이후, 침전된 pellet을 따서, Tris -Cl 용액에 넣고 녹인다.
4) 단백질과 함께 많이 들어있을 것으로 추정되는 ammonium sulfate들을 제거하여, Optimal 한 상태를 만들기 위해서, Dialysis를 buffer(Tris -Cl)에서 한다.
5) Column또한, 이 buffer를 투과시킴으로써, pH 8.4의 값을 가지도록 한다.
6) 투석한 용액을, column 속에 넣고, 그 위에 NaCl농도가 높아지는 Tris -Cl 용액을 계속 넣으면서 4ml씩 분획에서 걸러지는 용액을 받는다. 이는, 음이온 교환을 이용한 것으로, + 전하를 띄고 있는 resin에 , pH8.4에서 음전하를 띄는 LDH들을 부착시킨 후, 각각의 Isotype들을 Cl- 농도가 다른 용액들로 씻어줌으로써, 각 분획에서 LDH 들의 다른 Isotype 들을 받으려고 하는 것이다.
7) 이렇게 해서 나온 각 Fraction 들을, 단백질 정량과 Activity Assay 를 통하여, 단백질 량, 그리고 Activity를 측정한다. 이후, 이것은 Pooling을 하기 위한 것으로, 비슷한 농도 대에서 나온 2~3개의 fraction 들을 합쳐서 보다 많은 양의 용액을 만든다.

참고 자료

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