[생화학실험]Western Blot

소개글

항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 분석하는 western blot의 원리를 이해하고, 단백질의 SDS-PAGE분리, 단백질의 gel로부터 membrane으로의 transfer, 항체반응 및 항체에 부착된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험기법을 습득해보는 레포트입니다.

목차

1. 실험 목적
2. 실험 이론 및 원리
3. 실험 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 실험 결과
6. 토의 사항

본문내용

항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 분석하는 western blot의 원리를 이해하고, 단백질의 SDS-PAGE분리, 단백질의 gel로부터 membrane으로의 transfer, 항체반응 및 항체에 부착된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험기법을 습득한다.

실험 이론 및 원리
가. Immunoblot(western blot)의 원리
immuno blot이라고도 부르는 western blot은 antigen과 antibody사이의 특이적인 결합을 이용하여 시료 속에 위치한 단백질을 정성적/정량적으로 분석하는 방법이다. 단백질이 transfer되어있는 membrane에 원하는 단백질의 antibody를 넣어주면 항원 항체반응을 일으켜 antibody가 원하는 단백질 band에 붙게 된다. 이때 항체에는 효소가 결합되어있어 항원-항체 반응이 끝난 후 효소에 대한 기질을 넣어주면 효소가 있는 곳에서만 기질 반응이 일어나게 된다. 이러한 기질 반응은 색을 발하거나 형광을 발하는 침전물을 membrane 효면에 침전시킴으로써 검출이 가능하게 된다. 가장 민감한 검출방법은 chemieluminescent 기질을 이용하는 방법이다. 이 방법으로 주어진 시료에서 특정 단백질의 유무를 검출할 수 있고, band의 두께를 수치화 하여 단백질의 양도 알 수 있다.

나. Membrane transfer
blotting이라는 단어는 biological sample을 gel에서 membrane으로 옮겨 membrane표면에서 biological sample을 검출하는 것을 의미한다. electrophoresis에서와 마찬가지로 전류에 의해 transfer가 일어난다. 단백질이 들어있는 gel에 음극을 연결하고 membrane에 양극을 연결하면 SDS에 의해 negatively charged된 단백질은 buffer를 통해 membrane으로 이동한다.

다. Detection
검출 방법은 크게 direct detection과 indirect detection으로 나눌수 있다.

참고 자료

lehninger Principle of biochemistry 7th edition, David L Nelson, Michael M Cox, Freeman, 2017