서강대학교 현대생물학실험2 DNA isolation
- 최초 등록일
- 2018.07.29
- 최종 저작일
- 2017.11
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목차
1. Abstract
2. Introduction
3. Material and Method
4. Data and Result
5. Discussion
6. Reference
본문내용
이번 실험에서는 이전 실험에서 진행했던 TA cloning된 E.coli들이 형성한 Colony를 사용하여 Colony PCR을 사용하여 유전자가 cloning 되었는지 확인하였고, 이 E.coli들로부터 Plasmid DNA를 추출하였다. Colony PCR은 TA cloning이 되어있는 표적 DNA의 삽입과 형질전환 여부를 colony로부터 직접 확인하는 방법으로, PCR과 동일한 과정을 지니나, template DNA가 아닌 세균 colony를 사용하며, PCR 반응 중 고온 조건의 과정이 존재하는데, 이때 세균의 세포벽이 파괴되고 미량의 DNA를 검출할 수 있다. Colony PCR method의 장점으로는 빠른 확인이 가능하다는 것이며, 세균의 DNA를 extraction 하지 않고, colony 일부를 바로 튜브에 넣고 PCR 반응이 가능하며, E.coli나 그람 음상세균처럼 고온처리로 쉽게 세포벽이 깨지는 실험체의 경우 시간, 경제적인 면에서 용이하다. 또한 Colony PCR 과정에서 사용한 primer인 M13 primer에서의 M13은 replication origin이며 복제하여 virion을 형성할 때 ssDNA를 packing한다. M13 origin이 들어있는 plasmid가 E.coli 내에 들어가 있을 때에는 보통의 plasmid와 다를 바 없이 복제하나 helper phage를 감염시키면 helper phage가 plasmid의 M13 ori에 작용하여 M13 phage particle을 형성하게 한다. M13 phage particle은 이 과정을 통해 E.coli에서 extrusion하여 배지로 나오게 된다. M13 phage particle에는 ssDNA가 들어있어 plasmid sequencing, mutagenesis를 하기에 적합하다.
E.coli에서 plasmid DNA를 추출하는 방법으로 3가지가 있는데, 초고속 원심분리기를 이용하거나 chromatography를 이용하는 방법, 마지막으로 Alkaline lysis를 이용하는 방법이다.
참고 자료
Campbell Reece Simon(2008), Essential Biology, 2nd ed, p224
Daniel L. Hartl(2014), Essential Genetics, 6th ed, p215
Robert E. Hausman, Geoffrey M. Cooper(2013), The Cell, 6th ed, p17
