Competent cell preparation

목차

Ⅰ. Materials

Ⅱ. Methods

Ⅲ. Result
1. 2번 배지에는 대장균이 서식할 수 있었으나, 3번 배지에서는 다 죽은 이유.
2. 2번 배지에서 대장균이 블루/화이트로 나온 이유.

Ⅳ. Discussion
1. LB broth, LB plate
2.Ampicillin, plasmid DNA의 상관성
3. CaCl2 혹은 TSS buffer
4. X-gal/ IPTG
5. Competent cell (strains)

Ⅴ. Reference

본문내용

Ⅰ. Materials
DH5-a competent cell(E. coli), 1.5ml microcentrifuge, Ampicillin, LB plate, LB broth, 37℃ incubator, CaCl2 buffer, clean bench, pipette, tip, latex gloves, ice box, centrifuge, etc.

Ⅱ. Methods
competent cell preparation
1. E. coli를 5ml LB broth에서 37℃ overnight하여 충분히 기른다. (seed culture)
2. 그 중 2.5ml을 취하여 50ml LB broth에 넣고 37℃ 2-3시간 정도 키운다.
3. 4℃에서 7,000rpm으로 5분간 원심 분리한다.
4. Pellet을 남기고 상층액을 따라 버린다.
5. Pellet에 얼음위에 두었던 50mM CaCl2를 10ml 넣고 잘 녹여준다.
6. 얼음위에 15분간 두었다가 4번과 같이 원심분리를 한다.
7. 상층액을 버리고 50mM CaCl2를 200ul 넣고 녹여준다.
8. 100ul씩 tube에 나눠 담는다.
(즉시 사용하지 않을 시엔 15% glycerol을 첨가한 후 –80℃에 보관해준다.)
*모든 작업은 얼음 위에서 다룬다.

E. coli transformation
1. 5ul ligased DNA를 준비하여 50ul의 competent cell suspension에 넣는다.
2. 튜브를 조심히 흔들어 잘 섞이게 한 후 spin down한다.
3. 42℃ incubator에서 45초만 반응시킨다.
4. 얼음위에 5분간 식혀준 뒤 500ul의 LB broth를 넣고 60분 37℃에서 incubation한다.
5. 이 중의 50ul를 취하여 Ampicillin이 들어간 LB plate에 spreading한다.
6. 37℃ incubator에서 16시간 처리한다.

참고 자료

http://www.genehunters.co.kr/Training/01_2_2.htm
Cold spring harbor protocols, http://cshprotocols.cshlp.org/
Michael T. Madiga 외 3인, Brock의 미생물학 12판, p111~112
남상욱 외 2인, 유전공학의 이해 제 2판, p98~100
C. T. CHUNG el al. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution
Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 2172-2175