[실험프로토콜] western blot sample 제조

소개글

western blot sample을 만드는 방법입니다.
Cell lysis 의 경우 3가지 방법으로 설명했고, Protein quantify 의 경우 bradford assay와 BCA 를 이용한 방법 두가지를 설명해 두었습니다.. 단백질을 정량은 Softmax pro 5.4과 마이크로플레이트 리더를 이용하였고 "Softmax pro 5.4" 사용방법도 자세히 설명해 두었습니다!
그림으로 자세히 설명했기에 처음하시는 분들도 쉽게 따라하실 수 있을것입니다.

목차

1. Cell lysis (Method 1-3)
2. Protein quantify (Method 1-2)
3. Preparate SDS-PAGE gel loading

본문내용

1. cell lysis. (Method 1-3)
method 1. [Scriper Method]
1) cell 양을 현미경으로 check.(80%) → 배양액 제거. (suction)
2) 1X PBS 5-10㎖ washing → 1X PBS 제거. (suction) X 2회
- media와 동일한 양을 넣어줌.
: 6 well의 경우는 거의 3㎖.
- 죽은 세포나 떨어진 세포를 제거하여 씻어주는 역할.
- 마지막에는 세워서 잠시 둔 후 완전히 제거.
3) RIPA + PI(protein inhibit) 100㎕ 분주.
: RIPA 1ml +PI 10ul - RIPA는 trypsin과 동일 한 역할로 세포를 떨어뜨리는 역할.
- 보통 100Φ dish기준 200-300㎕ 4) 세포에 골고루 묻혀준 뒤 4℃ incubation 15-20min. (30min까지도 가능)
- 단백질이 변성될 수 있기에 온도는 4℃.
5) dish 위의 scraper로 세포를 직접 긁어내서 100㎕를 pipet을 이용해 최대한 microtube에 cell harvest.
- 이때 labeling을 잘못하면 문제가 될 수 있음.
- 지금부터는 단백질을 얻은 상태이기에 무조건 ice보관.
- 이 경우 -70℃에서 stop 가능.
6) sonicate.
(1) 전원 on. (기기의 아래)
(2) sonication에 물 + ice를 넣음.
- 이때 쇠에 닫지 않도록 1.5㎖ tube를 띄어줌.
- ice는 녹을 때 마다 계속 리필해줘야 함.
(3) sonication를 setting . setting ) Ampl : 60% / Time : 2min / Plus : on 2sec, off 2sec (2초간 반응 / 2초간 휴식) Temp : 조정X
(4) start 클릭.(틈틈히 ice의 양을 확인)
- 너무 오래하거나 뜨거우면 단백질, 세포가 탈수 있으므로 시간을 잘 맞춰줌.

참고 자료

없음