[식물생리학] 광합성,틸라코이드막 분리,힐리액션(Hill reaction) 실험

소개글

틸라코이드막 분리 실험
힐 반응 (Hill reaction) 실험

목차

I. Introduction
II. Material
III. Method
IV. Result
V. Discussion

본문내용

I.Introduction
1. 이론적 배경
식물은 여러 환경요인에 영향을 받아 생리활성이 능동적 또는 수동적으로 달라진다. 그중 광합성은 가장 민감한 대사과정의 하나라고 할 수 있다. 광합성은 명반응과 암반응으로 나눌 수 있고, 이 두 반응은 상호작용하여 각 반응의 상태는 다른 반응의 활성에 영향을 준다. 광합성 명반응은 엽록소에서 방출되는 형광으로 측정할 수 있다. 이 방법으로 광합성 기구의 구조 및 기능의 변이를 측정할 수 있는 데, 이는 시험관 수준의 연구에서 뿐만 아니라 잎을 파괴하지 않고 직접 측정이 가능하기 때문에 최근 스트레스 생리학에서 각광을 받고 있는 방법이다.
엽록소 형광은 주로 광계 2(photosystem II; PS II)에서 방출되기 때문에 엽록소 형광의 측정을 통한 기술은 주로 광계 2 활성의 변화를 보여준다. 광계 1의 활성은 광계 1(PSI)의 반응중심(reaction center; RC)인 P700의 산화환원에 따른 흡광도의 변화로부터 추적이 가능하며 이를 위한 비파괴적 측정기술 또한 최근에 개발되었다.

Methods
Thylakoid막의 분리 (Filtration and differential centrifugation)
실험 전 시금치를 ice 위에서 light를 최대한 가까이에서 쬐어준다.
약 1g의 시금치 잎에 10mL의 추출액을 4mL, 3mL, 3mL씩 첨가하여 유발에 sample이 남지 않도록 마쇄한다.
마쇄액을 4겹의 거즈를 사용하여 거른 후 1,200Xg (3000rpm 이상)에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 침전물을 10mL의 현탁액으로 현탁한다.
현탁액을 다시 1,000Xg (3000rpm)에서 3분간 원심분리한 후 상층액은 버린다.
침전물은 다시 10mL 정도의 현탁액으로 재현탁 한 후 다음 실험을 위해 보관한다.

Hill reaction&Chlorophyll fluorescence
11개의 test tube를 준비한 후 10개의 tube에 0.2mM DCPIP 1ml, phosphate buffer 2mL, thylakoid액 1mL을 넣고, 2개의 tube는 aluminum foil로 싸고, 또 다른 2개의 tube에는 20μL의 DCMU를 첨가한다. (DCMU의 반응농도는 50μM이 된다.
마지막 1개의 tube는 control로써 thylakoid액 대신 buffer 1mL을 더 넣는다.
각 2개씩의 test tube들을 광원으로부터 5, 10, 20cm의 거리에 두고 Control과 DCMU가 첨가된 tube들은 5cm의 거리에 둔다. 5분 정도 빛을 조사한 후 모든 tube에 빛을 차단한다. (5cm의 test tube의 파란색이 흐려질 때까지 반응시킨다.)
각 tube들의 흡광도를 600nm에서 측정한다. (blank는 현탁액)

참고 자료

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