protein expression

소개글

Fc protein expression과 expression된 Fc protein의 detection에 관한 생화학 레포트입니다.

목차

없음

본문내용

introduction
이번 실험의 목적은 E.coli transformation, IPTG induction, cell lysis, protein purification을 거쳐 우리가 원하는 Fc protein을 순수한 상태로 얻어낸 뒤, SDS PAGE, transfer, western blotting 과정을 거쳐 Fc protein이 제대로 얻어졌는지 확인하는 것이다.
Fc protein을 얻기 위해서는 먼저 Fc gene을 가지고 있는 plasmid를 competent cell로 넣어주는 과정인 E.coli transformation을 거쳐야 한다. competent cell이란 정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell이다. 우리가 실험에서 사용하는 cell인 BL21 DE3는 CaCl2 처리가 되어 DNA를 잘 받아들일 수 있는 competent cell이다. Ca2+가 세포벽을 약하게 하는 기능을 해 세포막으로 DNA가 들어가기 쉽다. transformation 시 heat shock을 가하면 competent cell의 membrane potential이 감소하여 cell로의 DNA 유입을 촉진된다.

<중 략>

column purification의 문제도 있을 수 있다. 실험에서 column에 binding buffer를 흘려보내고 cap을 닫은 뒤 binding buffer를 넣고 lysis한 supernatant를 넣는 과정을 거쳤다. 그 다음 cap을 닫고 inverting한 뒤 안의 solution을 흘려보냈다. binding buffer를 supernatant를 넣기 전과 바로 직전에도 처리해주었지만 너무 빠르게 흘려보내 protein A bead와 접촉하는 시간이 적어 제대로 작용하지 못했을 수 있다. 그래서 bead과 Fc protein의 binding이 잘 일어나지 못해 column washing 전에 흘러내려 갔거나 첫 번째 washing때 흘러내려가 wash sample에 Fc protein이 존재하지 않았을 수 있다. EB (IPTG+)에서도 band가 나오지 않았다는 점에서 Fc protein의 binding이 일어나지 못했거나 washing 전에 흘러내려 갔을 가능성이 크다고 생각된다.

참고 자료

Tomkinson, A.E., Vijayakumar, S., Pascal, J.M. & Ellenberger, T. (2006) Chem. Rev. 106, 687699.
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