Protein transfer&western blot

소개글

실험레포트

목차

I. Title

II. Introduction

III. Materials

IV. Methods

V. Result

VI. Discussion

VII. Reference

본문내용

I. Title : Western Blot (Immuno blotting)

II. Introduction
Western blot을 통해 target protein을 관찰할 수 있다. (유무, 상대적인 양, 위치, 분자량)
Western blot 분석법은 항체 분석법과 SDS-PAGE를 혼합한 것으로, 단백질을 크기와 항체의 결합여부로써 분석할 수 있는 방법이다. SDS-PAGE gel 상의 단백질을, 전기장을 걸어주어 나일론 or Nitrocellulose filter로 옮기는데, 이를 blotting 이라 하며, 단백질을 필터에 강하게 결합하게 된다. 필터에 primary antibody를 처리하고 씻어준 후, 효소가 결합되어 있는 secondary antibody를 이어서 처리한다. 이 secondary antibody에는 색이 있는 침전물을 만들거나 형광을 나타내는, detection할 수 있는 효소가 붙어 있다. 이 효소에 의해 생성된 색이 있는 침전물은 나일론 or Nitrocellulose filter에서 band로 확인할 수 있으며, 생성물이 형광을 나타내는 경우에는 자기 방사선 사진법을 통해 확인할 수 있다.

<중 략>

VI. Discussion
우리가 실험에서 detection하고자 했던 단백질 AP는 dimer형태로 약 180kDa의 분자량을 갖는 단백질이다. 이 단백질을 SDS-PAGE 거치면서 sample을 약 95℃에서 heating시켜주는 과정을 거쳤다. 이 때, 단백질 구조가 깨지면서 monomer형태가 되는데 이 때의 분자량은 약 83kDa으로 예상된다. 즉, protein marker의 약 83kDa에 해당되는 위치에서 membrane상의 band가 관찰되어야 한다. 하지만 실험 결과, Nitrocellulose membrane에서는 band형태가 아닌 전반적인 색 변화가 나타났다. 이는 특정 단백질을 detection하고자 했던 실험목적에 벗어난 실험상의 오류이다. 이런 오류가 생긴 원인은 여러 가지로 생각해볼 수 있다.
먼저, AP단백질 분해와 변성, 정제과정에서의 오류를 들 수 있다. AP단백질을 얻고 나서 western blot 과정을 하기까지 시간이 오래 지났기 때문에 아무리 온도조절을 해서 보관한다 하더라도 단백질 변성이 이미 시작되었을 가능성이 있다.

참고 자료

http://blog.naver.com/ghkdlxld5425?Redirect=Log&logNo=60023206869
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=shinek20&logNo=90015052221&widgetTypeCall=true
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=boxer_c&logNo=120144042208
http://cafe.naver.com/moleimmunology/756
http://bric.postech.ac.kr/myboard/read.php?Board=exp_qna&FindIt=EXT&FindIt1=KEYWORD&FindIt2=ALL&FindIt3=ALL&FindText=%20monoclonal&Page=1&id=177767&modetype=keyword