Enzyme activity assay, 효소 활성 테스트

소개글

1. pNPGal 이 beta-galactosidase에 의해 분해가 되면 pNP가 생성된다. 이 생성물을 정량 하여 beta-galactosidase의 activity를 측정 한다.
2. pNPGal 와 beta-galactosidase를 5, 10, 15, 20 min동안 50℃에서 반응하여 흡광도 값을 얻는다. 그 O.D.값을 standard curve와 비교하여 pNPGal에서 각 시간에 따른 pNP productivity를 구한다.

목차

실험목적

이론
- pNp assay원리
- pNp assay와 BSA assay에서 공통적으로 적용될 수 있는 요소
- pNp, pNp-galactopyranoside, beta-galactosidase 세 개의 관계
- enzyme unit이란?

실험재료

실험 기구 및 장치

실험 방법 1 & 2

실험결과

결과분석

참고문헌

본문내용

1. pNp assay원리
Phosphatase는 phosphate group을 인산화하는 효소이다. 이것은 모든 세포에서 발견되며 alkaline group과 acid group으로 분류된다. 이것의 인공적 기질로 p-nitrophenyl phosphate는 phosphatase 효소의 활성을 측정할 때 쓰인다.
반응 산물 중 하나는 p-nitrophenol인데, 여기에서 phosphate가 분리되면 염기조건에서 노란색으로 발색된다. 그리고 이 변화는 spectrophotometer를 이용하여 탐지할 수 있다.

<중 략>

4. enzyme unit이란?
효소량을 나타내기 위해 규정한 양으로 효소활성의 강도, 즉 일정조건에서 일정시간에 효소에 의해 촉매된 반응량으로 나타낸다. 단위시간에서의 반응량을 임의의 단위로 나타내면 되지만, 보통 1분동안 1μmol의변화를 하는 효소량을1단위(1unit, 기호 U 또는 I.U.)로 한다. 또한, 비활성을 단백질 1mg당의 단위 수로 나타낸다. 이것은 효소의 순도를 나타내는 지표가 된다. SI국제단위로서 1초당1mol의 반응을 하는 효소량을 1카탈(katal, 기호 kat)이라고 명명하고, 비활성을 단백질 1kg당의 kat수로 나타내는 것을 제안하고 있다.

실험 재료
1. Substrate : 2 mM pNPGal
2. Enzyme : 1 mg/ml
3. Reaction stop solution : Na2CO3
(NaOH는 강염기로 효소를 denaturation 시킨다. 또한 발색력을 높인다.)

실험 기구 및 장치
Water bath, e-tube, pipet, microcentrifuge tube, stop watch, vortex, tip, 비커

실험방법1(실험전 알려주신 내용)
1. 50℃ water bath heating
2. Enzyme dilution
-1 mg/ml의 enzyme을 0.01 mg/ml이 되도록 1 ml volume이 되도록 1/100로 dilution한다.
ex) 1/10 (900 ul : 100 ul) --> 1/10 (900 ul : 100 ul)
3. 1.5 ml microcentrifuge tube에 enzyme과 substrate를 1:1 (100 ul : 100 ul) 로 mix하여 각 시간 별 (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 min) sample을 준비한다.
-여기서 0은 blank로써 50℃에서 반응하지 않은 sample을 뜻함.
4. 50℃에서 반응 시키고 stop watch를 이용하여 각 시간에 도달하면 2 M Na2CO3를 20 ul (final 200 mM) 첨가하여 반응을 stop시켜주고 vortexing한 후 200 ul의 sample을 plate에 분주한다.

참고 자료

http://bric.postech.ac.kr/myboard/read.php?Board=exp_qna&Page=11&id=249505&modetype=newreply
http://www.UVm.edu/~biology/classes/001B/Labs/PDF/Labs9and10.pdf
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=434700
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=434726
http://en.wikipedia.org/wiki/4-Nitrophenol
http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB4704069.htm
http://kin.naver.com/qna/detail.nhn?d1id=11&dirId=1115&docId=148928936&qb=7Z2h6rSR64+E6rCAIDEg64SY7Jy866m0&enc=utf8§ion=kin&rank=1&search_sort=0&spq=0&pid=gIW86U5Y7vKssZEdOs8ssc--000305&sid=T6tg571cq08AAASDCTA