Western Blotting

소개글

생명과학실험 과목에서 작성한 레포트입니다.

목차

ⅠSubject
ⅡObject
ⅢIntroduction
ⅣMaterial
ⅤMethod
ⅥResults
ⅦDiscussion
ⅧReferences

본문내용

이번 실험은 그중 마지막 단계인, Detection이다. Detection은 앞의 SDS PAGE나 Transfer를 통해 얻어진 protein을 최종적으로 얻어내는 과정이므로 Western blotting에서 가장 중요한 과정이다. Detection에는 enzyme이나 radio isotope, fluorescent dye 등을 많이 이용한다. 본 실험에서는 enzyme을 이용했는데 보통 primary antibody를 원하는 protein에 binding시킨 후에 그 antibody에 specific하게 결합하는 secondary antibody에 enzyme을 붙여 detection한다. Horseradish peroxidase(HRPO) 또는 alkaline phosphatase(AP)가 여기에 많이 이용되며 이들 enzyme은 적당한 substrate가 있는 solution에서 그 substrate를 분해하여 coloring product를 생성한다. 그래서 우리는 그 enzyme의 존재와, 궁극적으로는 원하는 protein의 존재, 크기와 양에 대한 정보까지 확인할 수가 있다.

Detection에는 크게 1)Transfer, 2)Blocking, 3)Primary antibody 붙이기, 4)Secondary antibody 붙이기, 5)Detection 의 5단계의 과정이 있다. Blocking에서는 0.5% dry milk가 사용되는데 이는 target protein 사이사이의 비어있는 공간에 antibody가 약하게나마 결합할 수 있기 때문에 0.5% dry milk를 사용하여 이 공간을 막고 target protein만 드러나게 해주기 위함이다. Detection의 과정 중간의 Washing에서 washing solution으로 쓰이는 TBST는 계면활성제가 들어있어 비특이적인 결합을 떼어준다.

참고 자료

http://kr.ks.yahoo.com/service/wiki_know/know_view.html?tnum=131238
http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/western_blot.php
http://www.elpisbio.com/sub/support/protocols/western%20blotting.htm
http://biopedia.org/index.php/Western_Blotting