PCR을 이용한 cloning방법

소개글

pcr의 정의와 방법, pcr을 이용한 cloning방법, TA vector제조 방법, restriction enzyme을 붙인 primer를 이용한 cloning등을 순차적으로 제시,
PCR을 이용한 cloning의 troubleshooting

목차

PCR의 정의
PCR의 원리
PCR을 이용한 cloning 방법
T-vector
Primer에 enzyme site를 붙여서 cloning하는 방법
Uracil DNA glycocylase를 이용한 cloning
Cloning후 plasmid DNA 분리 method

본문내용

1. PCR의 정의 : Polymerase Chain Reaction,(PCR)은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 genome과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다.

2. PCR의 원리
1) DNA 의 변성 (Denaturation)
92 °C ~ 95 °C로 가열하여 이중가닥 DNA(dsDNA)를 단일가닥 DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 단일가닥 DNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA 중합효소도 온도가 아주 높은 상태에서는 변성되어 사용하지 못하게 될 수 있으므로 보통 94 °C로 한다. 첫 번째 cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킨다.
2) Primer의 결합 (Annealing)
50 °C ~ 65 °C에서 진행된다. Primer가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖고 있는 DNA 에 결합하는 단계이다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직 하다. 보통 30초가량 지속되는 이 단계에서 primer의 5`→3`방향으로 DNA의 합성이 시작된다.
3) DNA의 신장 (Elongation)
70 °C ~ 74 °C (Optimal temperature - 72 °C)에서 시행하며 원하는 PCR product의 크기가 크 거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq 중합효소는 보통 1분에 2,000-4,000 염기쌍을 중합할 수 있으므로 원하는 PCR산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배 당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle에는 약 10분 정도 시간을 주는 것이 좋다.

3. PCR을 이용한 cloning 방법
Figure . T-vector
1)T-vector
Figure . Phosphodiester bond between PCR product and T-vector

참고 자료

없음