PCR(Polymerase Chain Reaction),중합효소연쇄반응

소개글

PCR(Polymerase Chain Reaction)중합효소연쇄반응
실험을통해 증폭되는현상과 비교,분석을 통하여 UV사진을 찍고 차트를뽑아 base(염기)의 증폭을 연구해보았습니다.

목차

1. Title
2. Date
3. Name.
4. Introduction.
5.Methods.
6.Result.
7.Discussion

본문내용

중합 효소 연쇄 반응은 원하는 DNA의 특정부분만을 복제하고 증폭을 시킬 수 있는 기술이다.
이 기술은 많은 양의 DNA를 필요로 하지 않기 때문에 미량의 DNA를 사용하여 유용하게 사용할 수 있다. 또한 증폭을 하는 시간이 짧고 원하는 DNA를 선택적으로 증폭하며 실험이 단순하다. 그리고 기계로 증폭을 할 수 있기 때문에 유전공학, 범죄, 의료 등 DNA와 관련된 기술분야에서 중요하게 쓰이고 있다.
PCR의 원리 첫 단계는 이중쇄 DNA를 단일쇄 DNA로 열변성 시킨다. 두 번째 단계는 올리고 뉴클레오티드를 단일쇄 DNA에 결합 시키고 세 번째 단계는 결합한 올리고뉴클레오티드를 시발체로 하여 DNA폴리머라제에 의해 DNA를 합성하며 이상의 과정을 일정한 싸이클동안 반복한다. 이론적으로 매 PCR주기마다 증폭되는 DNA는 2배씩 늘어나야 하나 여러가지 이유에서 일정 주기가 지나면 증폭되는 DNA의 양이 안정기에 도달하게 된다. PCR로 증폭된 밴드를 에티디움 브로마이드로 염색된 아가로스 젤 에서 관찰하려면 약 50ng의 DNA가 필요한데 50ng은 300bp길이 DNA로 따지면 약 1011카피가 된다. 따라서 단일 copy의 300bp DNA를 증폭 후 전기영동하여 볼 수 있으려면 약 37 싸이클이면 된다. 그런데 1μl의 게놈 DNa에는 단일 카피 유전자가 3X10⁵카피 정도 있다고 추정되므로 일반적으로 30~40싸이클을 넘을 일은 거의 없고 보통 20~30싸이클이면 충분하다.


PCR에 필요한 요소들을 살펴보면
1. Taq 폴리머라제
온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 미생물에서 추출한 DNA 폴리머라제로 활성에 적당한 적정온도가 약 72℃이고 95℃에서의 반감기는 약 40분 가량 된다.
2. dNTPs
각각의 dNTPs가 0.2mM이 되도록 사용한다. 네 가지 dNTPs를 각각 2.5mM 또는 10mM이 되도록 혼합한 뒤 -20℃에 보관한다. 서로의 농도가 틀리면 잘못 들어갈 수 있고, 농도가 너무 낮으면 필요한 만큼의 DNA를 증폭하는데 지장이 있을 수 있고 너무 많으면 misincorporation의 확률이 높아진다.

3. Primer
Primer/주형DNA의 비는 특이적 PCR산물을 만드는데 매우 중요한데, Primer의 농도가 주형 DNA양에 비해 너무 높으면 dimer의 형성, mispriming 및 비특이적 산물이 많아지게 된다. 반면 너무 적은 양의 Primer가 들어가면 PCR 산물이 비례적으로 만들어지지 않으므로 새로 만들어진 가닥이 renaturation되기 쉽다.
4. 주형DNA
주형 DNA는 PCR반응시 Taq 폴리머라제의 표적이 되는 염기서열을 가지고 있는 DNA를 말하며 이는 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 증폭된 PCR 산물 등이 다 될 수 있다. 게놈 DNA의 경우 보통 0.1~1μg이 쓰이며 플라스미드 DNA는 1~10μg이면 충분히 증폭될 수 있다.
5. Buffer
KCL 완충액이 가장 많이 쓰이고 있으며, GC가 많은 구조를 PCR하려면 NaCl반응액을 쓰는 것이 PCR 산물의 반응 특이도를 높이는데 좋다.

이렇게 PCR에서 필요한 요소를 간단하게 살펴보았다. 이러한 요소들을 이용하여 DNA의 열변성, 결합, DNA 상보가닥 합성 세단계의 증폭을 25~35싸이클정도 시행하여 증폭이 되었는지 결과를 관찰한다. 앞서 보았듯이 이러한 과정을 토대로 본 실험에서는 PCR과정을 수행하여 DNA의 증폭에 관한 기술을 습득하고 결과를 살펴봄으로써 이 실험에 대한 목적과 원리를 파악하도록 한다.

참고 자료

없음