유전체 DNA분리(화학적 방법)

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유전체 DNA분리(화학적 방법)

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본문내용

세포에서 유전체 DNA를 따로 분리 하기 위하여 실험을 하였다. 처음에 lysozyme을 이용하여 세포벽을 파괴하는 과정을 거친 후 양이온 (++) chelating agent인 EDTA(ethylenediamine tetra-acetate)를 이용하여 이온을 제거함으로써 세포벽의 전체 구조를 약화시키는 과정 그리고 SDS(sod용하여 제거하는 과정 그리고 마지막으로 ethanol을 이용하여 DNA를 침전시키고 RNase를 이용하여 RNA를 제거하는 과정을 거처서 DNA를 분리하였다.
Method(실험방법)
LB배지에서 배양한 배양액 3ml를 (1.5ml 두번 씩 총 3ml) microcentrifuge tube에 옮겨 12,000rpm에서 30초 동안 원심분리를 하고 상층액을 버리고 0.5ml의 Tris-ESTA를 이용하여 tapping 및 vortexing으로 cell pellet을 잘 풀어주며 세포를 세척하였다. 여기서 너무 심하게 vortex하여 세포가 깨지지 않도록 주의한다. 새롭게 만든 lysozyme(10mg/ml) 용액을 최종 농도가 0.25mg/ml가 되도록 처리하여 37℃간 반응시켰다. 세포벽이 두꺼운 세균은 lysozyme 처리를 오래(15시간 이상) 한다. 그리고 5ul의 proteinase K(15mg/ml)와 70ul의 SDS(10% SDS)와 RNase 1ul를 처리한 후 잘 섞어 65℃에서 15분간 반응 시켰다. 그리고 100ul의 5M NaCl로 세포를 처리한 후 이어서 100ul CTAB/NaCl 처리하여 vortex하고 65℃에서 15분간 반응시킨 후 750ul의 chlorofoem/isoamyl alcohol(24:1)을 처리한 후 부드럽게 tube를 위아래로 뒤집기(inverting)를 반복해 골고루 시약을 섞었다. 상온에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리한 후 새 tube로 상층액을 옮기고 35ul 페놀을 넣고 잘 섞은 후 5초간 원심 분리 % ethanol가 들어있는 tube에 옮겨 놓고 DNA를 닦아 줬다. 심하게 tube를 흔들면 DNA가 소실될 수 있으므로 조심해서 다룬다. 그리고 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 뚜껑을 열어놓은 상태로 공기중에 물기를 말렸다. 너무 오래 말리면 DNA를 소실 할 수 있으므로 주의한다. 그리고 50ul DW,또는 TE buffer에 DNA를 녹여 4℃에서 보관 하였다.

참고 자료

미생물학 실험서 제 10과 유전체 DNA 분리 - 페이지 79~88