SDS-PAGE & Western Blotting Antibody Production
- 최초 등록일
- 2010.05.24
- 최종 저작일
- 2009.08
- 4페이지/
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소개글
Gel 만드는 방법을 익히고, membrane을 이용하여 transfer 된 단백질에 antibody를 붙여 확인하는 실험이었습니다.
1. running gel과 stacking gel로 구분해서 만드는 이유?
2. skim milk의 역할
위의 2가지에 대한 discussion이 있답니다.
많지는 않지만 실험 중간에 찍은 사진도 함께 넣었습니다.
목차
없음
본문내용
Purpose
Gel 만드는 방법을 익히고, membrane을 이용하여 transfer 된 단백질에 antibody를 붙여 확인할 수 있다.
Material
실험복, 실험용 장갑, 피펫, S.D.W, 40% Acrylamide, 1.5M Tris-Cl (pH8.8), 1M Tris-Cl (pH6.8) , 10% SDS, TEMED, 10% APS, coomassie blue, destaining buffer, running buffer, trans buffer, skim milk, 3M paper, magnetic bar, shaking 기계
Method
* gel 만들기
- 12% gel (running gel)
1. S.D.W 3.2ml
2. 40% Acrylamide 2.25ml
3. 1.5M Tris-Cl (pH8.8) 1.9ml
4. 10% SDS 75ul
5. TEMED 5ul
6. 10% APS 75ul
(ammonium persulfate)
- 5% gel (stacking gel)
1. S.D.W 1.82ml
2. 40% Acrylamide 0.31ml
3. 1M Tris-Cl (pH6.8) 0.32ml
4. 10% SDS 25ul
5. TEMED 5ul
6. 10% APS 25ul
* SDS-PAGE (maker - unstained blue)
1. gel을 흐르는 수둣물에서 천천히 분리한 후 petri dish에 옮긴다.
2. coomassie blue를 부어 40분간 염색을 시킨다.
3. destaining buffer를 넣어 약 20분간 반응 시킨다
4. D.W(수돗물)을 넣는다. (냄새가 사라질때까지)
* western blot (marker-prestained protein ladder)
1. 젤을 맞춘 후 젤 통안에 넣는다.
2. 1X running buffer를 붓는다.
3. sample-pin down
4. loading (smple-6ul, marker-6ul)
5. 120V, 1hr+a(30min)
(transfer)
1. 넓은 통에 1X trans buffer를 붓는다.
2. 흐르는 수돗물에서 gel을 천천히 분리한다.
3. 그 위에 검은색을 아래로 하고 판을 놓는다.
4. 스폰지를 올린 후 3M paper를 올린 후 gel을 올린다.
5. membrane을 그 위에 올린 후 3M paper를 올리고 마지막으로 스폰지를 올린다. (흰색과 검은색 판을 접는다.)
참고 자료
http://blog.naver.com/shinek20?Redirect=Log&logNo=90032568191
http://blog.naver.com/blueeyes8227?Redirect=Log&logNo=10029401987
http://blog.naver.com/juyoo7?Redirect=Log&logNo=130035007669