DNA Ligation, Competent cell prep & E. coli

소개글

DNA Ligation, Competent cell prep & E. coli

목차

Ⅰ. Abstract
Ⅱ. Introduction
Ⅲ. Materials
Ⅳ. Chemical reagent & Apparatus
Ⅴ. Methods
Ⅵ. Result
Ⅶ. Discussion
Ⅷ. Reference

본문내용

Ⅱ. Introduction

DNA Ligation
Ligation은 문자 그대로 DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정을 가리키는 용어이다. 이 반응에 이용되는 효소를 ligase라 하며 DNA를 기질로 사용하는 ligase를 DNA ligase, RNA를 기질로 사용하는 ligase를 RNA ligase라 한다. RNA ligase는 single strand의 DNA 또는 RNA 끼리 연결해 주는 효소로 5`-RACE와 같은 특수한 목적의 실험에서 사용될 수 있다.

유전자 재조합 과정에 사용되는 ligase는 주로 DNA ligase이며 이 효소는 원핵세포, 진핵세포, 바이러스 등에서 유래한 것이 있는데, 현재 많이 사용되는 ligase는 T4 DNA ligase와 E. coli DNA ligase이다. T4 DNA ligase는 cofactor로 ATP를 필요로 하고, E. coli ligase는 NAD+를 필요로 한다. 이들 두 ligase는 blunt-ended DNA, cohesive-ended DNA, nicked DNA등에 모두 작용할 수 있으나 E. coli DNA ligase 는 T4 DNA ligase와 비교할 때 blunt-ended DNA에 작용하는 힘이 약하므로 일반적인 유전자 재조합 과정에서는 T4 DNA ligase를 더 많이 사용하는 경향이 있다.

Ligation에 영향을 주는 factor
1) temperature
cohesive end의 종류와 길이에 따라 Tm의 값은 다르지만 일반적으로 15℃미만에서 반응한다. 효소의 최적온도는 37℃지만 5℃이하에서는 활성을 거의 나타나지 않기 때문에 Tm값과 최적온도사이의 절충한 온도로서 cohesive end의 ligation은 12~15℃에서 실시한다.
2) ionic concentration
3) DNA end type
4) relative concentration of DNA end
insert DNA가 없는 vector의 self-ligation을 방지하기 위하여 제한효소로 절단된 vector의 5‘말단에 달려있는 인산기를 alkaline phosphatase로 제거해준다.

참고 자료

1) 분자생물학 제2판 / 박상대 / 라이프사이언스 / 2003. 2. 21
2) 생화학 제2판 하 / 채범석 / 서울외국서적 / 1987. 2. 1
3) http://blog.naver.com/shanti78?Redirect=Log&logNo=40017325793
4) http://blog.naver.com/mua6738?Redirect=Log&logNo=150035230778
5) 유전공학 개론 / 김재호, 장해영 / 2001 / 청문당
6) http://blog.naver.com/dextermh?Redirect=Log&logNo=10010236663