웨스턴 블랏 - Western Blot

소개글

웨스턴 블랏 - Western Blot

목차

Ⅰ. Gel 만들기
Ⅱ. Electrophoresis
Ⅲ. Transfer(=Blotting)
Ⅳ. Blocking
Ⅴ. Washing & Antibody 붙이기.
Ⅵ. Detection

<추가 조사>
House Keeping Gene

본문내용

Western blot은 Antigen-Antibody reaction을 이용하여 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내는 방법이다. 이러한 Western blot 방법은 전기영동(Electrophoresis)으로 분리한 단백질의 검출을 쉽게 하거나 항원 단백질의 검출 및 sterodid-hormone receptor의 검출 등 각종 분석에 이용되고 있으며, 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.

Ⅰ. Gel 만들기
① gel을 만들기 위한 kit를 준비한 후 유리를 알코올로 닦아 준다. 이때 알코올이 유리에 남아있으면 이후 단백질을 흡착시켜 잘못된 실험 결과를 얻을 수 있으므로, 알코올을 티슈로 깨끗이 닦아준다.
② 10% separating gel 5ml를 만든다. (조성은 3차 증류수 + acrylamide + 1.5M Tris-Cl pH 8.8 + Ammonium + SDS + TEMED이며, 이때 사용하는 시약들은 모두 발암물질로 위험하므로 반드시 poly glove를 착용해야 한다.)
③ 잘 섞어준 뒤, 피펫을 이용하여 유리판에 두 번째 clip의 윗부분까지 잘 채운다. 그 후 증류수를 200㎕정도 gel의 위쪽에 골고루 넣어준다.(증류수를 넣어주는 이유는 gel위 윗부분을 평탄하게 만들기 위해서이다.) 이때 증류수 대신 Isopropyl alcohol을 넣어줄 수도 있다.
④ kit에 채우고 남은 gel을 빨리 굳혀서 버리고, 약 13분간 굳힌다.
⑤ 기다리는 동안 5% stacking gel 5ml를 만든다. (조성은 separating gel과 비슷하지만 1.5M Tris-Cl pH 8.8 대신 1.0M Tris-Cl pH 6.8이 쓰인다.)

참고 자료

없음