단백질 전기영동 (SDS-PAGE) 실험 리포트

소개글

전기영동 원리, running gel과 stacking gel 차이, 버퍼와 시약의 특징, 전기영동 장치 조립 방법, 샘플 제조 및 로딩, 염색 과정, gel 사진과 결과 분석 등의 내용입니다.

목차

1. 실험목적
2. 원리 및 이론
1. SDS-PAGE의 원리
2. Running gel과 stacking gel의 차이
3. SDS-PAGE에 이용되는 주요 시약의 특성
1) Acrylamide and bisacrylamide
2) APS (Ammonium persulfate) and TEMED (N, N, N`, N`-tetramethylethylenediamine)
3) SDS (Sodium dodecyl sulfate)
4) Coomassie Brilliant Blue
5) Silver nitrate
6) BSA (bovine serum albumin)
3. Hoefer® 전기영동장치 사용법
3. Method
4. Result
5. Discussion

본문내용

1. 실험목적
단백질 Bovine Serum Albumin과 Phosphorylase b를 전기영동하여 비교한다.
2. 원리 및 이론
1. SDS-PAGE의 원리
1960년대 중반 SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE)가 통상적인 단백질 분석을 위해 개발된 이후 높은 정밀도와 고분해능으로 인해 지금까지도 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용되고 있다. Polyacrylamide gel에는 중합되면서 가교를 형성하는 acrylamide, bisacrylamide monomer와 음이온성 detergent인 sodium dodecyl sulfate (SDS) 등을 이용한다 가진 이 detergent는 단백질의 소수성 부위에 결합하여 단백질의 삼차 구조를 풀어 선형으로 변화시킨다. 단백질은 일반적으로 그것을 구성하는 아미노산의 조성에 따라 양전하 또는 음전하를 띠지만, SDS 수용액 내에서 가열된 후 SDS-단백질 복합체의 음이온 전하의 수용성 상태로 존재하게 된다. 또한 β-mercaptoethanol 시약이 단백질의 S-S 결합을 끊기 위해 첨가될 수 있다. 이러한 원리로 인해 여러 소단위들로 구성된 단백질도 SDS-PAGE를 통해 여러 개의 펩타이드로 분리시켜 분



5. Discussion
SDS-PAGE로 분석한 BSA는 그 분자량이 68 kDa이고, phosphorylase b는 두 개의 97.4 kDa 소단위들전체 분자량은 195 kDa이다. 로딩한 단백질의 농도가 진해질수록 더 많은 양의 Coomassie blue와 결합하여 그 밴드가 점점 더 진해졌음을 볼 수 있었다. 분자량 마커를 함께 로딩하지 않아 젤 상에 나타난 밴드의 정확한 분자량을 알 수는 없었다. 그러나 다른 단백질이 오염되지 않았다는 가정하에 이미 알고 있는 정보를 이용하면 lane 1~고(그림 6, ▶), lane 5, 6의 밴드가 195 kDa의 phosphorylase b임을 알 수 있었다(그림 6, ▶). Phosphorylase b의 경우 dimer이고 이론적으로는 denaturation step를 거치면 이량체를 구성하는 소단위가 분리되어 97.4 kDa의 밴드가 나와야 하지만, 68 kDa의 BSA 밴드와 비교해봤을 때 migration

참고 자료

1. 한국생화학회, 실험생화학, pp100-110, 탐구당, 2004
2. Bruce Alberts, Molecular Biology of the Cell 4th Edition, pp152-153, pp485-489, Garland Science, 2002
3. Richard J. Simpson, Proteins and Proteomics, pp40-68, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003
4. David L. Nelson, Lehninger Principles of Biochemistry 4th Edition, pp92-93, W. H. Freeman and Company, 2005
5. Hoefer® Gel Electrophoresis Unit instruction manual,
=81#dl