연세대학교 생화학실험(2) - WesternBlot Analysis using His-Tag Antibody

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최초 등록일: 2009.09.21
최종 저작일: 2009.06; 5페이지/ 한컴오피스; 가격 1,000원

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Western blot을 통해 protein을 specific하게 detection해보고, 그 원리를 이해한다.

본문내용

◆ 목적 : Western blot을 통해 protein을 specific하게 detection해보고, 그 원리를 이해한다.
◆ 원리
* Western blot
Western blot은 protein에 대한 antigen-antibody 반응을 통해 특정 protein을 알아보기 위한 실험이다. Western blot은 membrane에 transfer 된 protein에 antibody를 붙여 확인 할 수 있는 실험이다.

실험순서: gel electrophoresis → Transfer → blocking → antibody addition → detection

* Transfer
gel에 있는 linear한 단백질을 membrane으로 옮기는 과정으로, 이동하는 동안 단백질로부터 SDS가 제거되고 단백질의 구조가 재생되면서 본래의 항원 결정기를 갖게 된다. Transfer되는 과정 동안 이동 효율은 분자량에 달려 있는데 분자량이 작은 단백질은 큰 단백질에 비해 효율성이 떨어진다. 이러한 문제는 메탄올을 처리함으로써 소수성 결합을 강화시켜 membrane에 잘 결합하도록 한다.

* Blocking
membrane 으로 protein이 transfer 된 후에 blocking이라는 것을 하는데, 이것은 membrane의 protein-untransferred 부분을 다른 균일한 protein으로 막아버리는 것으로서 더 이상 다른 미지의 protein(실험에 쓰일 antibody 등)으로부터 membrane이 오염되는 것을 방지하는 것이다.

* Antibody
일반적으로, 특정 protein을 생물체에 주입하게 되면, 생물체 내에서 체액성 면역반응을 유도하여, antibody를 생성하게 되고, 이 혈액을 채취하여 antibody purification을 통해 얻을 수 있다. 보통 antibody를 얻는 방법으로, protein을 어떤 동물에 injection하고, 혈액을 뽑아내서 centrifugation 시킨 후에, 혈청만 얻어낸다. 이 혈청 안에 있는 IgG를 다른 동물에 다시 주사한다. 이렇게 하면, 첫 번째 동물의 혈청 안에는 protein에 대한 primary antibody가 형성되고, 두 번째 동물의 혈청 안에는 첫 번째 동물의 IgG를 antigen으로 하는 secondary antibody가 형성되어 이용할 수 있게 된다. Secondary antibody에는 주로 AP(Alkaline phosphatase) 또는 HRP(Horseradish Peroxidase)등의 효소가 tagging 되어있다. 이 효소들은 적절한 substrate를 사용했을 때 효소반응을 통해 색을 내기 때문에 detection에 매우 유용하다.