연세대학교 생화학실험(2) - Sub-Cloning (1) Restriction digestion, elution and ligation of DNA

소개글

restriction enzyme을 이용하여 plasmid DNA를 digestion해 보고, agarose gel을 이용하여 DNA의 fragment 크기를 알아내본다. 또한 같은 restriction enzyme으로 잘린 DNA fragment(insert와 vector)를 ligase를 이용하여 이어본다.

목차

◆ 실험일자
◆ 제출자
◆ 목적
◆ 원리
◆ 시약 및 기자재
◆ 방법
◆ 결과
◆ Discussion
◆ 생각해봅시다.

본문내용

◆ 목적 : restriction enzyme을 이용하여 plasmid DNA를 digestion해 보고, agarose gel을 이용하여 DNA의 fragment 크기를 알아내본다. 또한 같은 restriction enzyme으로 잘린 DNA fragment(insert와 vector)를 ligase를 이용하여 이어본다.

◆ 원리
<restriction enzyme>
DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 endonuclease로서 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소이다. 원래는 bacteria 등의 host cell에서, 다른 DNA(virus 등의)가 침입했을 때, 침입한 DNA를 자신의 DNA와 식별하여 자기 방어system으로 그 DNA를 분해하기 위해 가지고 있는 효소이다.

<restriction enzyme의 종류>
* Type I : recognition sequence 로부터 1000 base pair 이상 떨어진 위치의 non- specific site를 자르고, ATP가 필요하다.
* Type II : 이번 실험에 사용하는 restriction enzyme으로, 4~6개의 nucleotide sequence(palindromic sequence)를 인식하여 sequence 내 또는 그 근처를 자르고, ATP는 필요하지 않고, 마그네슘 이온이 필요하다. 자르고 난 후 생기는 end에는 sticky end로는 5‘overhang과 3’overhang이 있고, overhang이 없는 Blunt end가 있다.
* Type III : recognition site로부터 24~26 bp downstream 떨어져 있는 site를 자르고 ATP가 필요하다.

<isoschizomer>
같은 sequence를 인식하고, 같은 부위를 자르는 같은 작용을 하는 enzyme이지만 서로 다른 source에서 분리해낸 enzyme들의 관계로, Pst1과 BstMAI, Xhol과 Stal의 관계가 그 예이다.

<Agarose gel electrophoresis>
DNA가 backbone의 phosphate 때문에 (-) charge를 띄고 있는 것을 이용하여, DNA를 (-)극에서 (+)극으로 이동시키는 방법이다. 크기가 작을수록 agarose gel을 잘 빠져나가서 많이 이동하고, 클수록 조금 이동하기 때문에, DNA의 크기를 알 수 있고, bend의 두께를 보고 대략적인 농도도 알 수 있다.

참고 자료

-생화학실험(2) 실험교본, 연세대 생화학과.
-Stryer Biochemistry 6th Ed, Freeman.
-http://www.enzynomics.com/?doc=prodata/enzyme05.php&pageNum=3&subNum=1
-http://cms.daegu.ac.kr/sgpark/molecular%20biology/%EC%9C%A0%EC%A0%84%EC%9E%90%EC%A1%B0%EC%A0%88.htm