Sephadex gel 여과에 의한 헤모글로빈의 분리 및 단백질 정량

소개글

실험 1 : Sephadex gel filteration에 의한 헤모글로빈(Hemoglobin)의 분리

실험 2 : Bradford법에 의한 단백질 정량
A. 표준곡선 작성
B. 시료의 흡광도 측정
C. 단백질의 purity 확인을 위한 SDS-PAGE

목차

Sephadex gel 여과에 의한 헤모글로빈의 분리 및 단백질 정량

실험 Ⅰ; Sephadex gel 에 의한 헤모글로빈의 분리
1. 실험 재료
2. 실험 과정
1) Sephadex 젤 준비와 column packing
2) Sample Preparation (시료준비)
3) Sample Loading
4) Elution
5) Analysis

실험Ⅱ; Bradford법에 의한 단백질 정량
1. 실험 재료
2. 실험 방법
A. 표준곡선 작성
B. 시료의 흡광도 측정
C. 단백질의 purity 확인을 위한 SDS-PAGE
※. 분광광도계 사용법 (OptizenⓇ)

본문내용

실험 Ⅰ; Sephadex gel 에 의한 헤모글로빈의 분리
1. 실험 재료 ; 크로마토그래피 glass column (20ml capacity volume, with fitted disc valve), sephadex G-100, PBS(인산완충액), fiber glass, 스포이드, 96well plate, whole blood, micro-pipette
500ml 비이커, 메스실린더, heat block, sonicator, 1.5ml & 2ml tube, centrifuge, 10ml syringe
sample : blue detran, whole blood lysate, bromophenol blue(BPB) 의 mixture


2. 실험 과정
1) Sephadex 젤 준비와 column packing
① gel suspension : Sephadex G-100을 (건조한 분말의 상태) 준비한다. 약 15g의 Sephadex G-100 에 400ml의 인산완충액 (PBS)을 가해 저어 주면서 실온에서 3일간, 혹은 물중탕 속에서 5시간 동안 부풀린다.
② gel particle 제거 : 메스실린더에 gel현탁액을 붓고 방치하여 젤이 가라앉으면 (95%정도) 상층액을 따라내고 다시 새 인산완충액을 첨가한 한 후 저어준다. 이 과정은 몇 번 반복한다.
③ 마지막으로 젤을 가라앉히고 상층액을 따라 낸 후 총 부피가 150ml 정도 되게 한다.
④ option : 젤 현탁액을 가지 달린 삼각 flask에 넣고 감압 하에서 30분 이상 충분히 탈기(deaeration, degasing : 녹아있는 기체를 제거)한다.
Figure 1. gel filtration chromatograph set ⑤ 크로마토그래피 column 의 밑부분에 유리섬유를 넣고 막은 후 인산완충액을 20ml 정도까지 붓는다.
⑥ 탈기한 젤 현탁액을 섞어준 후 유리막대를 통해 column 벽으로 흘려 넣어 꼭대기 까지 채운다.

참고 자료

생화학 실습